1. 蛋白提取

1.1 組織樣品

1)用滅菌的工具分離新鮮目的組織50-100mg，并用生理鹽水或PBS洗凈，用潔凈的剪刀將組織剪碎至合適大小。

2)將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，加入適量含有蛋白酶抑制劑（必要時還需要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液（每20mg組織加入150-250µl裂解液），冰上研磨2-5min，直到看不到明顯的大的細胞團塊，然后冰浴裂解30min，讓組織細胞充分裂解。可取少量裂解后組織液滴于載玻片，蓋上蓋玻片在光鏡下觀察確認是否裂解充分。

注：RIPA裂解液有不同裂解強度，可以根據(jù)組織類型進行調(diào)整，以提高裂解效率。

3)超聲處理10–15s，完成細胞裂解并剪切DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。超聲循環(huán)設置如下：超聲3s，暫停10s，重復3-5次。

注：為確保組織細胞充分裂解，建議進行超聲破碎。調(diào)節(jié)超聲儀至適宜頻率與功率（超聲功率不宜過大，并設置超聲間歇，以防止超聲探頭過度產(chǎn)熱），將超聲探頭置于樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進行冰浴超聲。

4)超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。

5)將上述裂解后樣品于4℃，12000rpm，離心15-20min，取上清到EP管，置于冰上備用。

1.2 細胞樣品

1)貼壁細胞：從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基，用1×PBS洗滌細胞后，加入適量含有蛋白酶抑制劑（必要時還需要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液（6孔板每孔100µl或10cm直徑的平板500µl），然后立即從板上刮下細胞并將提取物轉(zhuǎn)移至EP管，置于冰上。

懸浮細胞：將懸浮細胞連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管，室溫1000rpm離心5min，收集細胞沉淀，然后加入適量含有蛋白酶抑制劑（必要時還需要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液（6孔板每孔100µl或10cm直徑的平板500µl），吸打幾次后轉(zhuǎn)移至EP管，置于冰上。

2)超聲處理10–15s，完成細胞裂解并剪切DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。超聲循環(huán)設置如下：超聲3s，暫停10s，重復3-5次。

3)超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。

4)將上述裂解后樣品于4℃，12000rpm，離心15-20min，取上清到EP管，置于冰上備用。

2. 蛋白定量

2.1 配制工作液：根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按體積比A：B=50：1配制適量BCA工作液，充分混勻，BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 稀釋標準品：取10µl標準品用PBS稀釋至100µl，使終濃度為0.5mg/ml。將標準品按0，1，2，4，8，12，16，20µl加到96孔板的蛋白標準品孔中，加PBS補足到20µl。

2.3 將稀釋后（一般稀釋5倍）的適當體積樣品加入96孔板的樣品孔中，加PBS補足到20µl。

2.4 各孔加入200µl的BCA工作液，37℃放置30min。

2.5 將96孔板冷卻到室溫，用酶標儀562nm測定OD值，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。

注：對于濃度過高的樣品，建議用RIPA裂解液進行合理稀釋并充分混勻后，再測一次濃度為宜。

3. 樣品制備

3.1 上樣前建議用提取樣品用的RIPA裂解液將制備的組織、細胞蛋白樣品的濃度統(tǒng)一調(diào)整為相同濃度并充分混勻，最好都在3-5µg/µl。

3.2 上樣量為20-40µg（如果是純蛋白，上樣量為100ng），根據(jù)上樣量計算好體積，每管樣品分別與4×蛋白上樣緩沖液按體積比1：3混勻。

3.3 煮沸5-10min，使樣品還原變性，然后立即放于冰上備用。

3.4 剩余樣品可以統(tǒng)一加入4×蛋白上樣緩沖液后，保存在-20℃或-80℃。

4. 電泳

4.1 SDS-PAGE凝膠的制備：根據(jù)目的蛋白分子量，參考下表選擇合適的分離膠濃度灌制分離膠，加入保護層（可小心加入0.5ml去離子水封壓膠面）。待分離膠凝固后，倒出保護層的去離子水，再灌注濃縮膠。根據(jù)樣品數(shù)量和體積，選擇合適的梳子插入濃縮膠。待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)。

4.2 蛋白上樣與電泳：將上述變性處理后的樣品短暫低速離心后，按照實驗設計的上樣順序，分別加入樣品孔中。最后，加入合適的預染蛋白Marker。濃縮膠恒壓80V，分離膠150V電壓條件下電泳，直至指示劑溴酚蘭遷移至凝膠底部。

4.3 電泳合格標準：目的蛋白條帶位于分離膠的中部，并且條帶充分分離。

5. 考馬斯亮藍染色（備選步驟）

在進行正式實驗前，對于剛制備的蛋白樣品，可取少量上樣電泳后，把整張膠用考馬斯亮藍染色進行初步鑒定，以確定樣品的質(zhì)量。然后，再進入正式實驗。

6. 蛋白轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法）

6.1 將PVDF膜在無水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5min。膠也可以在轉(zhuǎn)膜液中平衡3-5min，防止轉(zhuǎn)膜時條帶變形。

6.2 濕轉(zhuǎn)“三明治"排列順序：海綿/濾紙/膠/膜/濾紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠與膜之間不能留有氣泡。膜的面積：5.2*8.4cm，濾紙的面積：4條邊均略長于膜的4條邊。

6.3 安裝方向：負極與膠同側(cè)，向正極方（膜）遷移。

6.4 200-300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間可參考下表。

7. 蛋白染色（備選步驟）

將膜置于麗春紅工作液中，在室溫下?lián)u動1-5min，待蛋白帶顯示后用TBST或超純水洗凈膜上麗春紅。

8. 封閉

為避免一抗與膜發(fā)生非特異性結(jié)合而造成背景提高，需要對膜上的潛在非特異性結(jié)合位點進行封閉處理。

8.1 封閉條件：用TBST溶解的5%的脫脂奶粉或5%的BSA（建議提前配制，使奶粉或BSA充分溶解），室溫封閉1h。

8.2 注意事項：

1)脫脂奶粉不能用于磷酸化蛋白檢測。因為脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用脫脂奶粉時，磷酸化抗體可能也會與奶粉中的磷酸化蛋白結(jié)合，從而產(chǎn)生高背景。

2)生物素標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

3)某些抗體用BSA封閉時也可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強的信號，建議參照抗體說明書進行實驗。

9. 一抗孵育

9.1 用WB一抗稀釋液（整張膜建議使用5-10ml），按一定比例（一般為1：1000-1：2000）稀釋一抗。

9.2 倒掉封閉液，將膜置于適量一抗孵育液中，4℃水平搖床孵育過夜。

9.3 用TBST洗膜3次，每次5min。

10. 二抗孵育

10.1 用WB二抗稀釋液按一定比例（HRP標記二抗1：5000-1：10000；熒光二抗1：10000-1：20000）稀釋二抗。

10.2 將膜置于適量二抗孵育液中，水平搖床室溫孵育1h。

10.3 用TBST洗膜3次，每次5min。

11. 顯影

11.1 化學發(fā)光法（使用HRP偶聯(lián)的二抗）

1)制備ECL工作液：A液和B液等體積混勻后即可使用。

2)將膜有蛋白的一面朝上平鋪在一張平板上，將工作液均勻滴加在膜上，孵育1-5min。用量以充分覆蓋膜為準，每10cm²膜需要大約1ml工作液。

3)用合適的照相器材直接記錄蛋白膜的化學發(fā)光圖或使用X射線膠片曝光，曝光5s-1min，通過調(diào)整X片的曝光時間獲得最佳結(jié)果。

11.2 熒光底物法（使用熒光二抗）

將膜上多余的TBST瀝干，使用合適的熒光掃描儀，根據(jù)制造商的建議掃描膜上條帶。